詳細(xì)分析杜恩斯勻漿器的操作步驟流程
更新時(shí)間：2019-11-20 點(diǎn)擊次數(shù)：1894次
杜恩斯勻漿器的電源是兩個(gè)AA干電池，可直接用在離心管里勻漿，配上不同的槌和管便可實(shí)現(xiàn)從0.5ml至50ml的組織勻漿；勻漿快速，便用輕便，操作簡(jiǎn)單，無(wú)需特別維護(hù)。提供無(wú)菌包裝，無(wú)DNA酶和RNA酶，無(wú)致熱源的一次性使用槌；也有可反復(fù)使用的聚丙烯（PP）材料槌和不銹鋼（SS）槌。
1、獲得目的基因：
a、通過PCR方法：以含目的基因的克隆質(zhì)粒為模板，按基因序列設(shè)計(jì)一對(duì)引物，PCR循環(huán)獲得所需基因片段。
b、通過RT-PCR方法：用TRIzol法從細(xì)胞或組織中提取總RNA，以mRNA為模板，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA第1鏈，以逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物為模板進(jìn)行PCR循環(huán)獲得產(chǎn)物。
2、構(gòu)建重組表達(dá)載體：
a、杜恩斯勻漿器載體酶切：將表達(dá)質(zhì)粒用限制性內(nèi)切酶進(jìn)行雙酶切，酶切產(chǎn)物行瓊脂糖電泳后，用膠回收Kit或凍融法回收載體大片段。
b、PCR產(chǎn)物雙酶切后回收，在T4DNA連接酶作用下連接入載體。
3、獲得含重組表達(dá)質(zhì)粒的表達(dá)菌種：
a、將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α，根據(jù)重組載體的標(biāo)志作篩選，挑取單斑，堿裂解法小量抽提質(zhì)粒，雙酶切初步鑒定。
b、測(cè)序驗(yàn)證目的基因的插入方向及閱讀框架均正確,進(jìn)入下步操作。否則應(yīng)篩選更多克隆，重復(fù)亞克隆或亞克隆至不同酶切位點(diǎn)。
c、以此重組質(zhì)粒DNA轉(zhuǎn)化表達(dá)宿主菌的感受態(tài)細(xì)胞。
4、誘導(dǎo)表達(dá)：
a、杜恩斯勻漿器挑取含重組質(zhì)粒的菌體單斑至2mlLB（含Amp50μg/ml）中37℃過夜培養(yǎng)。
b、按1∶50比例稀釋過夜菌，一般將1ml菌加入到含50mlLB培養(yǎng)基的300ml培養(yǎng)瓶中,37℃震蕩培養(yǎng)至OD600≌0.4-1.0（*0.6，大約需3hr）。
c、取部分液體作為未誘導(dǎo)的對(duì)照組,余下的加入IPTG誘導(dǎo)劑至終濃度0.4mM作為實(shí)驗(yàn)組,兩組繼續(xù)37℃震蕩培養(yǎng)3hr。
d、分別取菌體1ml,離心12000g×30s收獲沉淀，用100μl1%SDS重懸，混勻,70℃10min。
e、離心12000g×1min，取上清作為樣品,可做SDS-PAGE等分析。
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